Методы исследования. Метод определения активности основных карбоксипептидаз

Материалы по биологии » Активность плаценты при гестозах » Методы исследования. Метод определения активности основных карбоксипептидаз

Активность КПН определяли флюорометрическим методом Fricker и Snyder [153].

Для определения активности КПН 50 мкл гомогената ткани добавляли к 150 мкл (в случае опытной пробы) 50 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5,6, содержащего 50 мМ NaCl, или к смеси 140 мкл вышеуказанного буфера и 10 мкл 25 мкМ водного раствора ингибитора ГЭМЯК (в случае контрольной пробы). Далее пробы преинкубировали 8 минут при 37˚С. Реакцию начинали прибавлением 50 мкл предварительно нагретого до 37˚С 210 мкМ раствора дансил-фен-ала-арг, приготовленного на воде (конечная концентрация в реакционной смеси 42 мкМ). Пробы инкубировали 60 минут при 37˚С. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1М раствора HCl.

Для экстракции продукта реакции дансил-фен-ала к пробам приливали по 1,5 мл хлороформа, интенсивно встряхивали в течение 60 с. Хлороформную и водную фазы разделяли центрифугированием в течение 10 минут при 1000 об/мин.

Измерение флюоресценции хлороформной фазы проводили на флюориметре ФМЦ-2 при λex=360 нм и λem=530 нм в кювете толщиной 1 см. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-фен-ала в хлороформе.

Активность фермента определяли как разность прироста флюоресценции в пробах, не содержащих и содержащих ГЭМЯК, и выражали в нмоль дансил-фен-ала, образовавшегося за 1 минуту инкубации в пересчете на 1 мг белка.

Для определения активности ФМСФ-ингибируемой КП 50 мкл гомогената ткани добавляли к 150 мкл (в случае опытной пробы) 50 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5,6, содержащего 50 мМ NaCl, или к смеси 140 мкл вышеуказанного буфера и 10 мкл 25 мМ ингибитора ФМСФ, приготовленного на этаноле, который добавляли после смешивания гомогената ткани с буфером (в случае контрольной пробы). Пробы преинкубировали 8 мин при 37˚С, затем вносили 50 мкл предварительно нагретого до 37˚С 210 мкМ раствора дансил-фен-лей-арг, приготовленного на воде. Далее пробы обрабатывали как описано для КПH. Активность фермента определяли как разницу в приросте флюоресценции в пробах, не содержащих и содержащих ФМСФ и выражали в нмоль дансил-фен-лей, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.

Концентрацию белка оп­ределяли методом Лоури [80].


Прочие статьи:

Биохимия микроорганизмов
Микрооганизмами принято называть мельчайшие живые существа, размеры которых меньше или немногим превышают разрешающую способность человеческого глаза (0,2 мм). Число известных микроорганизмов составляет много тысяч, причем открываются все ...

Ионийский период (600-450 до н.э.):
В результате самостоятельного развития, а также на основе определённого запаса знаний, заимствованных у вавилонян и египтян, математика превратилась в особую научную дисциплину, основанную на дедуктивном методе. Согласно античному предани ...

Молекулярная биология
Прогресс в области изучения макромолекул до второй половины нашего века был сравнительно медленным, но благодаря технике физических методов анализа, скорость его резко возросла. У. Астбери ввел в науку термин «молекулярная биология» и пр ...